Trizol protocollo di estrazione di rna , trizol

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protocollo di estrazione di RNA Trizol TRIZOL® Cat reagente. No. 15596-026 Dimensioni: 100 ml Conservare a 2-8 ° C. ATTENZIONE: Tossico a contatto con la pelle e per ingestione. Provoca ustioni. In caso di contatto con la pelle, lavare abbondantemente con acqua e detergente. In caso di malessere, consultare un medico (mostrare l'etichetta se possibile). Fenolo (108-95-2) e altri componenti (NJTSRN 80100437-5000p). TRIZOL ha dimostrato la stabilità di 12 mesi se conservato a temperatura ambiente. Tuttavia, si consiglia di conservazione a 2-8 ° C per ottenere prestazioni ottimali. Descrizione: TRIZOL Reagent (U. S.Patent No.5,346,994) è un reagente pronto all'uso per l'isolamento di RNA totale da cellule e tessuti. Il reagente, una soluzione mono-fasica di fenolo e guanidina isotiocianato, è un miglioramento del metodo di isolamento di RNA a singolo passo sviluppato da Chomczynski e Sacchi (1). Durante omogeneizzazione campione o lisi, TRIZOL reagente mantiene l'integrità dell'RNA, mentre interrompendo cellule e dissolvendo componenti cellulari. L'aggiunta di cloroformio seguita da centrifugazione, si separa la soluzione in una fase acquosa ed una fase organica. RNA rimane esclusivamente nella fase acquosa. Dopo il trasferimento della fase acquosa, l'RNA viene recuperato per precipitazione con alcol isopropilico. Dopo la rimozione della fase acquosa, il DNA e proteine ​​nel campione possono essere recuperati per precipitazione sequenziale (2). Precipitazione con etanolo produce DNA dall'interfase, ed una precipitazione supplementare con alcool isopropilico produce proteine ​​dalla fase organica (2). Copurification del DNA può essere utile per normalizzare le rese di RNA da campione a campione. Questa tecnica comporta bene con piccole quantità di tessuto (50-100 mg) e le cellule (5 × 106), e grandi quantità di tessuto (≥1 g) e cellule (> 107), di umana, animale, vegetale, o di origine batterica . La semplicità del metodo TRIZOL reagente consente l'elaborazione simultanea di un gran numero di campioni. L'intera procedura può essere completata in un'ora. L'RNA totale isolato da reagente TRIzol è privo di proteine ​​e la contaminazione del DNA. Può essere utilizzato per l'analisi Northern blot, dot blot ibridazione, poly (A) + selezione, traduzione in vitro, test RNase protezione e clonazione molecolare. Per l'impiego nella reazione a catena della polimerasi (PCR *), il trattamento del RNA isolato con l'amplificazione di grado DNasi I (Cat. No. 18068) è consigliato quando i due primer si trovano all'interno di un singolo esone. TRIZOL reagente facilita l'isolamento di una varietà di specie di RNA di grandi o piccole dimensioni molecolari. Ad esempio, RNA isolato da fegato di ratto, elettroforesi su gel di agarosio, e colorati con bromuro di etidio, mostra bande discrete di alta RNA peso molecolare compreso tra 7 kb e 15 kb di dimensioni, (composto di mRNA e di hnRNA di) due bande di RNA ribosomiale predominanti a 2 kb (18S), e basso peso molecolare dell'RNA tra 0,1 e 0,3 kb (tRNA, 5S). L'RNA isolato ha un rapporto A260 / A280 ≥1.8 quando diluito in TE. Precauzioni per la Prevenzione RNase Contaminazione: RNasi possono essere introdotti accidentalmente nella preparazione di RNA in qualsiasi punto della procedura di isolamento attraverso la tecnica impropria. Poiché l'attività di RNasi è difficile da inibire, è indispensabile per evitare la sua introduzione. Le seguenti linee guida devono essere osservate quando si lavora con l'RNA. • Indossare sempre guanti monouso. Pelle spesso contiene batteri e muffe che possono contaminare una preparazione di RNA e di essere una fonte di RNasi. Pratica buona tecnica microbiologica per prevenire la contaminazione microbica. • Utilizzare sterili, monouso e plasticware pipette automatiche riservate per il lavoro RNA per evitare la contaminazione incrociata con RNasi da apparecchiature condiviso. Ad esempio, un laboratorio che utilizza sonde di RNA sarà probabilmente utilizzando RNasi A o T1 per ridurre background su filtri, e tutti gli elementi nondisposable (ad esempio pipette automatiche) possono essere ricche fonti di RNasi. • In presenza di TRIZOL reagente, RNA è protetta dalla contaminazione RNasi. manipolazione del campione a valle richiede che vetreria nondisposable o plasticware essere RNase-free. articoli di vetro possono essere cotti a 150 ° C per 4 ore, e oggetti di plastica possono essere immersi per 10 minuti in 0,5 M NaOH, sciacquati accuratamente con acqua e autoclave. Altre precauzioni: • L'utilizzo di tubi monouso in polipropilene trasparente è consigliato quando si lavora con volumi meno di 2 ml di reagente Trizol. • Per i volumi più grandi, l'uso di vetro (Corex) o tubi di polipropilene, e test per essere sicuri che i tubi possono resistere a 12.000 × g con reagente Trizol e cloroformio. Non utilizzare i tubi che fuoriescono o crack. • equilibrare attentamente i pesi dei tubi prima della centrifugazione. • tubi di vetro devono essere sigillati con parafilm sormontato da uno strato di alluminio, e tubi di polipropilene devono essere tappate prima della centrifugazione. ISTRUZIONI PER L'ISOLAMENTO RNA: Attenzione: Quando si lavora con il reagente TRIzol utilizzare guanti e occhiali protettivi (scudo, occhiali protettivi). Evitare il contatto con la pelle o con gli abiti. Utilizzare in una cappa. Evitare di respirare i vapori. Salvo diversamente specificato, la procedura viene eseguita a 15 a 30 ° C, e reagenti sono da 15 a 30 ° C. Reagenti necessari, ma non forniti: • Cloroformio • alcool isopropilico • il 75% di etanolo (in acqua DEPC trattati) • RNase-free acqua o 0,5% soluzione di SDS [Per preparare acqua priva di RNasi, attingere l'acqua in bottiglie di vetro RNase-free. Aggiungere dietilpirocarbonato (DEPC) allo 0,01% (v / v). Lasciate riposare durante la notte e in autoclave. La soluzione SDS deve essere preparato utilizzando DEPC trattati con acqua, autoclave.] 1. omogeneizzazione (vedi note 1-3) a. I tessuti omogeneizzare campioni di tessuto in 1 ml di reagente Trizol per 50-100 mg di tessuto usando un vetro-Teflon o omogeneizzatore potere (Polytron, o TISSUMIZER® di Tekmar o equivalente). Il volume del campione non deve superare il 10% del volume di TRIZOL reagente utilizzato per omogeneizzazione. b. Cellule coltivate in cellule monostrato Lisare direttamente in un piatto di cultura con l'aggiunta di 1 ml di reagente Trizol per un piatto di diametro di 3,5 cm e passando il lisato cellulare più volte attraverso una pipetta. La quantità di TRIZOL reagente aggiunto si basa sulla superficie del piatto di coltura (1 ml per 10 cm2) e non sul numero di cellule presenti. Una quantità insufficiente di reagente TRIzol può provocare la contaminazione del RNA isolato con il DNA. c. Cellule coltivate in cellule in sospensione a pellet per centrifugazione. Lisare le cellule in reagente Trizol di pipettaggio ripetitivo. Usare 1 ml di reagente per 5-10 × 106 di cellule animali, vegetali o lievito, o per 1 × 107 cellule batteriche. cellule lavaggio prima aggiunta di reagente TRIzol dovrebbero essere evitati in quanto questo aumenta la possibilità di degradazione dell'mRNA. Turbativa di alcune cellule di lievito e batteriche può richiedere l'uso di un omogeneizzatore. OPTIONAL: può essere necessario un passo ulteriore isolamento per i campioni con alto contenuto di proteine, grassi, polisaccaridi o materiale extracellulare come i muscoli, tessuto adiposo, e parti di piante tuberose. Dopo omogeneizzazione, rimuovere il materiale insolubile dall'omogeneizzato per centrifugazione a 12.000 xg per 10 minuti a 2 e 8 ° C. Il pellet risultante contiene membrane extracellulari, polisaccaridi, e DNA ad alto peso molecolare, mentre il surnatante contiene RNA. In campioni di tessuto grasso, un eccesso di grasso raccoglie come strato superiore che deve essere rimossa. In ogni caso, trasferire la soluzione omogenato eliminato in una nuova provetta e procedere con cloroformio aggiunta e la separazione di fase, come descritto. 2. FASE DI SEPARAZIONE Incubare i campioni omogeneizzati per 5 minuti a 15 a 30 ° C per permettere la completa dissociazione dei complessi nucleoproteina. Aggiungere 0,2 ml di cloroformio per 1 ml di TRIZOL reagente. tubi campione Cap in modo sicuro. Agitare tubi vigorosamente a mano per 15 secondi e incubare a 15 a 30 ° C per 2 o 3 minuti. Centrifugare i campioni a non più di 12.000 × g per 15 minuti a 2-8 ° C. Dopo la centrifugazione, la miscela si separa in un rosso, fase inferiore fenolo-cloroformio, una interfase, e una fase acquosa superiore incolore. RNA rimane esclusivamente nella fase acquosa. Il volume della fase acquosa è circa il 60% del volume di TRIZOL reagente utilizzato per omogeneizzazione. 3. RNA PRECIPITAZIONE Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta, e salvare la fase organica, se l'isolamento di DNA o proteine ​​si desidera. Precipitare il RNA dalla fase acquosa miscelando con alcool isopropilico. Utilizzare 0,5 ml di alcool isopropilico per 1 ml di TRIZOL Reagent usato nella omogeneizzazione iniziale. Incubare campioni a 15 a 30 ° C per 10 minuti e centrifugare a non più di 12.000 × g per 10 minuti a 2 e 8 ° C. Il precipitato di RNA, spesso invisibile prima della centrifugazione, forma un pellet simile a gel sul lato e fondo del tubo. 4. RNA LAVAGGIO Rimuovere il surnatante. Lavare il pellet di RNA una volta con etanolo al 75%, aggiungendo almeno 1 ml di 75% di etanolo per 1 ml di TRIZOL reagente utilizzato per l'omogeneizzazione iniziale. Mescolare il campione su vortex e centrifugare a non più di 7,500 g per 5 minuti tra 2 e 8 ° C. 5. ridissoluzione IL RNA Al termine della procedura, asciugare brevemente il pellet di RNA (aria secca o sotto vuoto a secco per 5-10 minuti). Non asciugare la RNA mediante centrifugazione sotto vuoto. È importante non lasciare il pellet di RNA asciugare completamente come questo diminuisce notevolmente la sua solubilità. campioni di RNA parzialmente disciolti hanno un / 280 rapporto di 200 mg DNA A260 o grandi quantità di un materiale non-DNA. 3. ridissoluzione IL DNA asciugare il DNA da 5 a 15 minuti in un tubo aperto. (Non asciugare SOTTO centrifugazione; sarà più difficile da sciogliere.) Sciogliere il DNA a 8 mm di NaOH tale che la concentrazione di DNA è 0,2-0,3 mg / mL. Tipicamente aggiungere 300 - 600 ml di 8 mm di NaOH al DNA isolato da 107 cellule o 50 - 70 mg di tessuto. Risospendere in base debole è altamente raccomandato dal DNA isolato non risospendere bene in acqua o in buffer Tris. Il pH del 8 mM NaOH è solo 9 e deve essere facilmente regolata con TE o HEPES volta che il DNA è in soluzione. In questa fase, le preparazioni di DNA (specialmente da tessuti) possono contenere materiale simile a gel insolubile (frammenti di membrane, ecc) Rimuovere il materiale insolubile mediante centrifugazione a> 12.000 g per 10 minuti. Trasferire il surnatante contenente il DNA in una nuova provetta. DNA solubilizzati in 8 mM NaOH può essere conservato a 4 ° C; Per una conservazione prolungata, i campioni devono essere regolate con HEPES a pH 7-8 (vedi tabella) e integrati con 1 mM EDTA. Una volta che il pH viene regolato, il DNA può essere conservato a 4 ° C o - 20 ° C. Quantificazione e rendimenti attesi di DNA Prendere una aliquota della preparazione del DNA solubilizzato in 8 mm di NaOH, mescolare con acqua e misurano la A260 della soluzione risultante. Calcolare il contenuto di DNA utilizzando il valore A260 per il DNA doublestranded. Una unità A260 è uguale a 50 mg di doppia elica del DNA / ml. Per il calcolo del numero di cellule in campioni analizzati, si supponga che la quantità di DNA per 1 × 106 cellule diploidi di origine del mouse umana, ratti, ed è pari a: 7,1 mg, 6,5 mg, e 5,8 mg, rispettivamente (3). Applicazioni: amplificazione del DNA tramite PCR: Dopo ridissoluzione il DNA in 8 mm di NaOH, regolare il pH a 8,4 con 0,1 M HEPES (vedi tabella). Aggiungere 0,1 a 1,0 mg di campione di DNA alla miscela di reazione di PCR ed eseguire il protocollo standard di PCR. Reazioni endonucleasi di restrizione: Regolare il pH della soluzione di DNA ad un valore desiderato con HEPES (vedi tabella). In alternativa, i campioni possono essere dializzati contro 1 mM EDTA, pH 7 a pH 8,0. Utilizzare 3-5 unità di enzima per microgrammo di DNA. Utilizzare le condizioni raccomandate dal produttore per il particolare enzima, e consentire la reazione di procedere per 3 a 24 h. In un saggio tipico, 80-90% del DNA è digeribile. Regolazione pH di campioni di DNA disciolto in 8 mm NaOH: (per 1 ml di 8 mm di NaOH utilizzare i seguenti importi di 0,1 M o 1 M HEPES, acido libero.) PH finale 0,1 M HEPES (ml) pH finale 1 M HEPES (pl ) 8,4 86 7,2 23 8,2 93 7,0 32 8,0 101 7,8 117 7,5 159 Note isolamento del DNA: 1. La fase di fenolo e interfase possono essere conservati a 2-8 ° C per una notte. 2. I campioni sospesi in etanolo al 75% possono essere conservati a 2 e 8 ° C per mesi. 3. I campioni disciolti in 8 mm di NaOH possono essere memorizzati durante la notte a 2-8 ° C. Per la conservazione a lungo termine, regolare il pH a 7-8, e regolare la concentrazione EDTA 1 mM a. ISTRUZIONI PER PROTEINE DI ISOLAMENTO: Le proteine ​​sono isolate dal supernatante fenolo-etanolo ottenuto dopo precipitazione del DNA con etanolo (step 1, DNA precipitazione). Il preparato risultante può essere analizzato per la presenza di proteine ​​specifiche mediante Western blotting (2). Reagenti necessari, ma non forniti: • alcool isopropilico • cloridrato 0,3 M Guanidine in etanolo al 95% • Etanolo • 1% SDS 1. precipitazione delle proteine ​​proteine ​​precipitato ottenuto dal supernatante fenolo-etanolo (volume approssimativo 0.8 ml per 1 ml di reagente Trizol) con alcool isopropilico. Aggiungere 1,5 ml di isopropanolo per 1 ml di TRIZOL reagente utilizzato per l'omogeneizzazione iniziale. Conservare i campioni per 10 minuti a 15 a 30 ° C, e sedimentare il precipitato proteico a 12,000 g per 10 minuti a 2 e 8 ° C. 2. PROTEINE LAVAGGIO Rimuovere il surnatante e lavare il pellet di proteine ​​3 volte in una soluzione contenente 0,3 M guanidina cloridrato in 95% di etanolo. Aggiungere 2 ml di soluzione di lavaggio Per1 ml di TRIZOL reagente utilizzato per l'omogeneizzazione iniziale. Durante ogni ciclo di lavaggio, memorizzare il pellet di proteine ​​nella soluzione di lavaggio per 20 minuti a 15 a 30 ° C e centrifugare a 7500 xg per 5 minuti a 2 e 8 ° C. Dopo l'ultimo lavaggio, agitare la pellet di proteine ​​in 2 ml di etanolo. Conservare il pellet di proteine ​​in etanolo per 20 minuti a 15 a 30 ° C e centrifugare a 7500 xg per 5 minuti a 2 e 8 ° C. 3. ridissoluzione IL PELLET vuoto PROTEINE asciugare il pellet di proteine ​​per 5-10 minuti. Sciogliere in 1% SDS pipettando. completa dissoluzione del precipitato proteico può richiedere l'incubazione del campione a 50 ° C. Sedimenti qualsiasi materiale insolubile mediante centrifugazione a 10.000 g per 10 minuti a 2 ÷ 8 ° C, e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Il campione è pronto per l'uso in Western blotting o può essere conservato a -5 e -20 ° C per un uso futuro. Note isolamento delle proteine: 1. Il pellet di proteine ​​sospesi in 0,3 M guanidina cloridrato-etanolo al 95% o in etanolo possono essere conservate per almeno un mese tra 2 e 8 ° C, o per almeno un anno a -5 a -20 ° C. 2. Il protocollo che segue è un approccio alternativo che permette il recupero più efficiente delle proteine. Dializzare il supernatante fenolo-etanolo contro tre cambi di 0,1% SDS tra 2 e 8 ° C. Centrifugare il materiale dializzato a 10.000 g per 10 minuti. Utilizzare il surnatante chiaro per Western blotting. 3. Le proteine ​​possono essere quantificati con il metodo Bradford finché la concentrazione di SDS è sufficientemente bassa (Nome: Ridham Collegamento Post precedenti archivio